Analyses moléculaires sur la plateforme

Actuellement, il n’est pas réalisé d’analyse d’oncogénétique constitutionnelle (recherche dans un prélèvement sanguin d’une mutation germinale d’un gène de prédisposition aux cancers tel que BRCA1, BRCA2, APC …) dans les laboratoires de la plateforme hospitalière de génétique moléculaire des cancers PACA-Est. A l’issue des consultations d’oncogénétique, les prélèvements sanguins des patients sont adressés à des centres de référence d’autres plateformes nationales.

Notre plateforme hospitalière de génétique moléculaire des cancers PACA-Est est toutefois impliquée dans la réalisation d’analyses préliminaires à ces analyses d’oncogénétique constitutionnelles dans le cadre du dépistage du syndrome de Lynch. Il s’agit d’analyses immunohistochimiques ou moléculaires somatiques réalisées à partir d’un tissu tumoral, obtenu par biopsie ou exérèse. Le prélèvement est le plus souvent effectué dans le contexte d’un cancer du côlon, et parfois de cancer de l’endomètre ou autres tumeurs du spectre du syndrome de Lynch. Les résultats de ces analyses permettront dans certains cas l’orientation du patient vers une consultation d’oncogénétique ou à l’onco-généticien de décider d’entreprendre la demande de réalisation d’analyses mutationnelles.

Recherche de perte d’expression des protéines du système MMR et recherche d’instabilité des séquences micro-satellites dans le cadre du dépistage du syndrome de Lynch (http://www.e-cancer.fr/).

1. Indications.

Les analyses sont réalisées dans les cas suivants:

-prescription de l’analyse par un onco-généticien à l’issue d’une consultation d’oncogénétique (consultations oncogénétiques) , sur la base des données familiales et personnelles du patient (par exemple, cancers du spectre du syndrome de Lynch, comme des cancers du côlon non polyposiques, cancers de l’endomètre… chez plusieurs personnes apparentées au premier degré, à un âge précoce de survenue etc…).

-recherche à titre systématique dans les prélèvements de cancer du côlon adressés dans les laboratoires de biologie moléculaire de la plateforme hospitalière de génétique moléculaire des cancers PACA-Est si le patient est âgé de moins de 60 ans (recommandation de l’Institut National du Cancer depuis 2011).

-à la demande de l’anatomo-pathologiste, sur la base de critères cliniques, morphologiques et immunohistochimiques (par exemple, cancer colo-rectal colloïde).

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2. Analyses moléculaires : recherche d’instabilité des séquences microsatellites, complétée si nécessaire par recherche de mutation du gène BRAF.

Principe.
Après extraction d’ADN, nous recherchons des modifications dans la séquence de petits motifs répétés d’ADN appelés « microsatellites ». En raison de leur structure comportant des multiples répétitions de bases nucléotidiques, surtout les bases A et C, ces séquences « microsatellites » sont tout particulièrement des cibles d’erreurs au moment de la réplication de l’ADN. Ces erreurs sont normalement réparées par un assemblage de protéines, les protéines du système de réparation des mésappariements de l’AD (MMR=MisMatchRepair). Les quatre principales protéines de réparation sont MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2. En cas de déficience d’une ou plusieurs de ces protéines, le système de réparation fonctionne mal et l’accumulation de ces erreurs se traduit par un phénotype instable. La déficience d’une protéine de réparation peut être constitutionnelle et favoriser l’apparition de tumeurs comme dans le cas du syndrome de Lynch ou bien sporadique, uniquement dans les cellules tumorales, notamment lorsqu’il se produit une hyperméthylation du promoteur du gène MLH1.
Les défaillances du système MMR induisent des délétions ou des insertions de quelques nucléotides se traduisant par une variation de la taille de ces séquences microsatellites. C’est cette variation que nous recherchons pour définir si une tumeur présente une instabilité des séquences microsatellites (MSI : microsatellite instability).
Selon les recommandations internationales qui avaient été définies lors d’une réunion de consensus à Bethesda en 1997 et révisées en 2002, cinq marqueurs microsatellites mononucléotidiques (BAT-25, BAT-26, NR21, NR24 et NR27) sont étudiés. Ces cinq marqueurs ont en effet été sélectionnés car ils présentent des profils monomorphes et l’instabilité est facilement détectée dans le tissu tumoral sans avoir besoin d’une comparaison systématique avec l’étude d’un tissu non tumoral.
Néanmoins pour certaines localisations tumorales comme l’endomètre, dans lesquelles l’instabilité des microsatellites est moins prononcée, conduisant à des variations de taille de ces marqueurs plus discrètes et plus difficiles à identifier, une comparaison avec l’ADN normal correspondant des patients reste recommandée (Hamelin et al. Bull Cancer 2008 ; 95 (1) : 121-32).
Méthodes.
La première étape est une extraction de l’ADN tumoral. Puis, en utilisant des séquences oligonucléotidiques spécifiques de chacun des cinq marqueurs, ceux ci sont amplifiés par réaction à la polymérase en chaîne (PCR) multiplexe. On pratique cette réaction « en fluorescence » en incorporant des nucléotides liés à un fluorochrome. La taille des fragments amplifiés est ensuite estimée par visualisation sur une échelle de mesure d’intensité de la fluorescence après migration par électrophorèse capillaire. La présence d’une instabilité se traduit par l’apparition « d’allèles » surnuméraires (augmentation du nombre de pics de fluorescence).
Les tumeurs présentant une instabilité de deux ou plus de ces marqueurs sont définies comme instables (phénotype « MSI-high ») tandis que les tumeurs montrant l’instabilité d’un seul marqueur ou ne montrant pas d’instabilité sont considérées comme stables(phénotypeMSS).
Analyse moléculaire complémentaire : recherche de mutation du gène BRAF.
Il a été montré que certaines instabilités des séquences microsatellites surviennent de manière sporadique dans les tumeurs, c’est à dire sans être associée à un syndrome de prédisposition au cancer. Une des causes d’instabilité sporadique est la méthylation du promoteur du gène MLH1. Différentes études ont identifié une association entre une mutation du gène BRAF et la présence d’instabilité des séquences microsatellites lorsque il s’agissait d’instabilité sporadique : la mutation du gène BRAF est très rare dans les instabilités liées au syndrome de Lynch.
Ainsi, en pratique lorsque nous identifions une instabilité des séquences microsatellites dans une tumeur, nous pratiquons une recherche systématique de mutation de l’exon 15 du gène BRAF. Le résultat donnera un élément d’orientation et de probabilité d’une instabilité sporadique ou liée à un syndrome de prédisposition (suspicion du caractère héréditaire).

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3. Analyses immuno-histochimiques : recherche de perte d’expression des protéines du système MMR.

Les analyses immuno-histochimiques sont réalisées sur des coupes du tissu tumoral avec des anticorps dirigés contre les protéines du système MMR et marqués par un chromogène. Lorsqu’il n’y a pas de déficience des protéines du système MMR, un marquage nucléaire intense est observé. En cas de déficience, il sera observé au contraire une perte d’expression.

La recherche immuno-histochimique est pratiquée:

à l’issue des analyses moléculaires, lorsqu’une instabilité a été constatée. Elle permettra alors une confirmation de la déficience et donnera de plus une orientation sur celui des quatre gènes potentiellement inactivé.
sur la base d’éléments cliniques ou anatomo-pathologiques

Expression de la protéine MLH1 (tumeur colique) Perte d’expression de la protéine MHL1

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4. Les laboratoires de la plateforme hospitalière de génétique moléculaire des cancers effectuant les analyses moléculaires de recherche d’instabilité des séquences microsatellites.

Centre Antoine-Lacassagne

Laboratoire d’Onco-pharmacologie, responsable : Dr G. Milano, Centre Antoine Lacassagne, 33 avenue de Valombrose, 06189 Nice cedex 02

CHU de Nice

Laboratoire de génétique des tumeurs solides, responsable : Pr. F. Pedeutour, Faculté de médecine, 28 avenue de Valombrose, 06107 Nice Cedex 02